Le système immunitaire inné des enfants les protègerait contre les formes graves de Covid-19, selon une étude allemande

L'immunité innée antivirale préactivée dans les voies respiratoires supérieures contrôle l'infection précoce par le SRAS-CoV-2 chez les enfants

Résumé

Les enfants ont réduit les taux d’infection par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) et un risque considérablement plus faible de développer une maladie à coronavirus sévère 2019 par rapport aux adultes. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la protection dans les groupes d’âge plus jeunes restent inconnus. Ici, nous caractérisons le paysage transcriptionnel unicellulaire dans les voies respiratoires supérieures des  enfants SARS-CoV-2-négatifs ( n  = 18) et SARS-CoV-2 positifs du même âge ( n = 24) et des échantillons correspondants d’adultes ( n  = 44), couvrant une tranche d’âge de 4 semaines à 77 ans. Les enfants présentaient une expression basale plus élevée des récepteurs de reconnaissance de formes pertinents tels que MDA5 ( IFIH1 ) et RIG-I ( DDX58) dans les cellules épithéliales des voies respiratoires supérieures, les macrophages et les cellules dendritiques, entraînant des réponses antivirales innées plus fortes lors de l’infection par le SRAS-CoV-2 que chez les adultes. Nous avons en outre détecté des sous-populations distinctes de cellules immunitaires, notamment KLRC1 (NKG2A) + cellules T cytotoxiques et une population de cellules CD8 + T avec un phénotype mémoire survenant principalement chez les enfants. Notre étude fournit des preuves que les cellules immunitaires des voies respiratoires des enfants sont préparées à la détection du virus, ce qui entraîne une réponse antivirale innée précoce plus forte à l’infection par le SRAS-CoV-2 que chez les adultes.

Principale

Il a été rapporté à plusieurs reprises que les personnes plus jeunes ont un risque sensiblement plus faible de développer une maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), malgré un risque d’infection similaire, comme en témoigne une mortalité considérablement accrue avec l’âge 1 , 2 , 3 . Ces observations suggèrent que les enfants peuvent avoir une capacité plus élevée de contrôler l’infection par le SRAS-CoV-2. Il a été démontré qu’une réponse immunitaire innée intrinsèque à la cellule précoce, médiée par les récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) et le système d’interféron de type I et III (IFN), est cruciale pour le contrôle réussi de l’infection par le SRAS-CoV-2 4. Conformément à ces observations, des études récentes ont comparé des adultes et des enfants atteints de COVID-19 sévère ou ceux se présentant à un service d’urgence et ont décrit une réponse IFN altérée dans le COVID-19 pédiatrique (réf.  5 , 6 ). Cependant, les mécanismes moléculaires protégeant contre COVID-19 dans les groupes d’âge plus jeunes, en particulier chez ceux qui ne présentent aucun ou seulement des symptômes légers/modérés, restent inconnus.

Pour comprendre la capacité plus élevée des enfants à contrôler l’infection par le SRAS-CoV-2 à un stade précoce, nous avons systématiquement caractérisé le paysage transcriptionnel des voies respiratoires supérieures, une région des voies respiratoires à forte susceptibilité à l’infection par le SRAS-CoV-2 7 , dans le SRAS-CoV- Enfants et adultes 2-négatifs et SARS-CoV-2-positifs.

Résultats

Composition cellulaire différente dans les voies respiratoires supérieures des enfants et des adultes

Nous avons inclus des participants à l’étude de trois cohortes COVID-19 différentes : l’étude RECAST axée sur le COVID-19 chez les enfants et leurs familles, l’étude Pa-COVID-19 et l’étude SC2 8 , 9 , y compris SARS-CoV-2-négatif et Enfants SARS-CoV-2 positifs ( n  = 42) et adultes ( n  = 44). L’ensemble de données dérivé comprenait 268 745 cellules au total (Fig.  1a ). Des échantillons des voies respiratoires supérieures (nez) ont été prélevés sur des individus âgés de 4 semaines à 77 ans avec un résultat PCR positif pour le SRAS-CoV-2 ainsi que des témoins négatifs pour le SRAS-CoV-2 du même âge (tableaux supplémentaires  1 et 2 ). En se concentrant sur l’infection précoce, seuls les cas légers/modérés de COVID-19 ont été pris en compte pour cette étude (Fig. 1a ). Sur la base des données de séquençage de l’ARN monocellulaire (scRNA-seq), nous avons identifié 33 types ou états cellulaires différents dans les voies respiratoires supérieures de ces individus, dont 21 sous-types de cellules immunitaires et 12 sous-types de cellules épithéliales (Fig.  1b et Extended Data Fig. .  1a, b ). Nous avons observé des différences frappantes entre les participants aux études pédiatriques et adultes concernant la composition des cellules immunitaires et du compartiment des cellules épithéliales dans la muqueuse nasale. Alors que les cellules immunitaires étaient rarement détectées dans les échantillons nasaux d’adultes en bonne santé, les échantillons d’enfants négatifs pour le SRAS-CoV-2 contenaient des quantités élevées de presque chaque sous-ensemble de cellules immunitaires avec une dominance globale de neutrophiles (Fig.  1b, c et données étendues Fig. 2a). Chez les adultes, l’infection par le SRAS-CoV-2 était associée à un afflux de cellules immunitaires, tandis que la proportion de cellules immunitaires et épithéliales restait presque stable chez les enfants (Fig.  1c et données étendues Fig.  2a ). Lors de l’infection, les neutrophiles des enfants ont montré un phénotype activé qui était plus prononcé que chez les adultes infectés, caractérisé par l’expression accrue de, par exemple, CCL3 et CXCR1 / 2 (tableau supplémentaire  4 ).

Fig. 1 : Modifications de la composition cellulaire des voies respiratoires supérieures en fonction de l’âge.
Figure 1

a , des échantillons nasaux d’enfants ( n  = 42) et d’adultes ( n  = 44) ont été collectés auprès d’individus négatifs et positifs (asymptomatique/léger/modéré COVID-19) pour le SARS-CoV-2 et soumis à scRNA-seq. b , Approximation et projection uniformes de variétés (UMAP) montrant tous les types et états de cellules immunitaires et épithéliales individuelles identifiés. MC/basophiles, mastocytes ou basophiles ; moMa, macrophages dérivés de monocytes; nrMa, macrophages non-résidents ; rMa, macrophages résidents ; mDC, cellules dendritiques myéloïdes ; CD11c_mDC, mDC exprimant CD11c; pDC, cellules dendritiques plasmacytoïdes; DNT, cellules T doublement négatives ; NK, cellules tueuses naturelles ; NKT, cellules T tueuses naturelles; p_NKT, cellules NKT proliférantes; ag_T, cellules T vieillissantes ; CD8_Tm, mémoire CD8 +cellules T; CTL1 et CTL2, cellules T cytotoxiques de type 1 et 2 ; IL-17A_CD8, cellules T CD8 exprimant IL-17A; IL-17a_CD4, IL-17A exprimant les cellules CD4 + T ; p_T, cellules T en prolifération ; Cil-diff, différenciant les cellules ciliées ; Epi_low RNA, cellules épithéliales à faible ARN; Cellules FOXN4, FOXN4 + . c , Les UMAP à l’échelle affichant 45 000 cellules par groupe révèlent des différences prononcées dans la composition des cellules nasales des enfants et des adultes SARS-CoV-2-négatifs et positifs. , Tableau montrant tous les types/états cellulaires significativement différents entre les enfants et les adultes chez les individus non infectés. Les différences moyennes en pourcentage sont données ; des valeurs positives indiquent un nombre plus élevé de cellules de la population cellulaire respective chez les enfants par rapport aux adultes. Les comparaisons ont été effectuées par le test de Kruskal-Wallis suivi d’une comparaison post-hoc bilatérale de Dunn avec la correction de Benjamini-Hochberg (*** P  < 0,001 ; Neutrophil, 5,54 × 10 −7 ; CD8_T m , 1,97 × 10 −4 ; CTL2, 1,83 × 10 −5 ; Basal, 6,96 × 10 −5 ; Cilié, 9,18 × 10 −7 ; voir également les données étendues Fig.  2a ). e, Diagrammes de dispersion représentant les changements de cellules immunitaires et épithéliales spécifiques au fil du temps. Sont représentés les pourcentages du type/état cellulaire respectif par rapport à toutes les cellules pour les cellules immunitaires (à gauche) ou les cellules épithéliales (à droite) de chaque individu. Les individus négatifs pour le SARS-CoV-2 sont indiqués en gris, les individus positifs pour le SARS-CoV-2 en rouge. Les lignes représentent les résultats d’ajustement de courbe par régression polynomiale locale (LOESS). Les valeurs P sont issues d’une analyse de régression linéaire (Benjamini-Hochberg ajusté bilatéral).

Fait intéressant, de nombreuses populations de cellules épithéliales ont montré une nette dépendance à l’âge avec, par exemple, des cellules caliciformes diminuant et des cellules ciliées augmentant avec l’âge (Fig.  1d,e ). Une étude complémentaire récente a analysé la composition cellulaire de la muqueuse nasale chez des enfants sains et infectés par le SRAS-CoV-2 sur la base de méthodes de RNA-seq en vrac et de déconvolution cellulaire. Les auteurs n’ont pas été en mesure d’identifier les cellules caliciformes spécifiques aux enfants, mais ont plutôt décrit que les échantillons d’enfants en bonne santé étaient dominés par une signature cellulaire ciliée, soulignant les limites des approches d’ARN en vrac 10 .

Les récepteurs d’entrée du SRAS-CoV-2 ne sont pas exprimés de manière différentielle chez les enfants par rapport aux adultes

Le niveau d’expression de ACE2 , codant pour le récepteur d’entrée du SRAS-CoV-2, et de TMPRSS2 , FURIN , CTSB , CTSL et CTSV , codant pour les protéases associées à l’entrée, était similaire entre les enfants et les adultes et n’était pas régulé à la hausse par le COVID-19 léger/modéré comparé à l’état non infecté (Extended Data Fig.  2b ). Par conséquent, ces facteurs d’entrée virale ne peuvent pas expliquer les différences de physiopathologie du SRAS-CoV-2 entre les enfants et les adultes.

Les enfants montrent une détection virale améliorée dans les cellules épithéliales des voies respiratoires

Le SRAS-CoV-2 est un virus à ARN à brin positif avec un taux de réplication très élevé 11 , 12 . Par conséquent, le contrôle de l’infection par le SRAS-CoV-2 nécessite une immunité antivirale innée précoce et coordonnée optimale. Cette réponse est activée par divers PRR. Récemment, des preuves de plus en plus nombreuses ont été générées à l’appui de MDA5 ( IFIH1 ) en tant que PRR majeur pour le SRAS-CoV-2 dans les cellules épithéliales avec RIG-I ( DDX58 ) jouant peut-être un rôle supplémentaire, mais mineur, 13 , 14 (propres données non publiées ). LGP2 ( DHX58 ) 15 est un amplificateur important de la détection de l’ ARN viral par MDA5 .. Il est important de noter que les PRR, en particulier MDA5 et LGP2, ne sont que faiblement exprimés dans de nombreux types de cellules épithéliales, mais sont profondément régulés à la hausse par une régulation de rétroaction positive lors de l’infection virale de la cellule ou par une exposition paracrine à l’IFN de type I ou III. La dynamique de cette régulation par rétroaction est cruciale pour le contrôle réussi d’un virus infectieux (Fig.  2a ). L’importance de l’axe PRR/IFN pour la résolution réussie de l’infection par le SRAS-CoV-2 a été récemment démontrée par des études cliniques trouvant une forte association entre les erreurs innées à divers loci du système PRR/IFN avec un risque accru de COVID-19 sévère (réf.  16). De même, et affectant même une fraction beaucoup plus large de patients, il a été démontré que les auto-anticorps dirigés contre les IFN de type I se produisent à une fréquence remarquablement élevée chez les patients atteints de COVID-19 sévère (réf.  17 ).

Fig. 2 : Détection virale améliorée dans les cellules épithéliales des enfants.
Figure 2

a , Représentation schématique de la réponse épithéliale à l’infection par le SRAS-CoV-2, y compris les gènes impliqués dans la détection du virus et la réponse IFN ultérieure ; créé avec BioRender.com . b , tracés de points représentant l’expression de gènes de détection de virus dans les cellules épithéliales d’enfants et d’adultes. Chaque augmentation significative comparant les enfants SARS-CoV-2-négatifs ( n  = 18) avec les adultes SARS-CoV-2-négatifs ( n  = 23) et les enfants SARS-CoV-2-positifs au début (jours après l’apparition de symptômes (dps) ≤ 4, n  = 11) ou phase d’infection tardive (dps 5-12, n  = 11) avec des adultes positifs pour le SRAS-CoV-2 au début ( n  = 13) ou tard ( n = 8) la phase d’infection, respectivement, est marquée par un cercle rouge (bilatéral ajusté selon Benjamini-Hochberg, Wilcoxon P  < 0,05). Ave. exp., expression génique moyenne; PCT exp., pourcentage de cellules exprimant le gène. c , Graphiques de violon montrant l’expression de gènes de détection de virus prototypes dans les cellules épithéliales de patients positifs pour le SRAS-CoV-2 ( n  = 45) par rapport aux jours après les premiers symptômes. d , Carte thermique montrant l’expression à l’échelle de 171 ISG représentatifs dans toutes les cellules épithéliales au début de la phase d’infection par le SRAS-CoV-2 (dps ≤ 4). Seuls les gènes sélectionnés sont annotés ; pour une carte thermique entièrement annotée, voir Extended Data Fig. 3 . e, Expression différentielle des ISG sélectionnés dans un modèle in vitro comparant la réponse à l’infection par le SRAS-CoV-2 dans les cellules MDA5 (codées par IFIH1 )-surexprimant A549 ACE2 et les contrôles vectoriels vides. n  = 3 répétitions biologiquement indépendantes ; les barres d’erreur indiquent la moyenne ± sem ; * P  < 0,05, *** P < 0,001 ( IFNB1 , 5,47 × 10 −4 ; MX1, 2,63 × 10 −2 ; BST2 , 8,74 × 10 −4 ; RSAD2 , 4,24 × 10 −2 ; IFIT1 , 1,30 × 10 − 2 ) à partir du test t de Student unilatéral.

Notamment, nous avons trouvé un niveau d’expression basale significativement plus élevé des gènes codant pour RIG-I, MDA5 et LGP2 dans les cellules épithéliales des voies respiratoires supérieures des enfants en bonne santé par rapport aux adultes (Fig.  2b ). Ce résultat suggère une capacité accrue de la muqueuse respiratoire des enfants à répondre aux infections virales, qui est en outre soutenue par les quantités très accrues de cellules immunitaires innées dans leurs voies respiratoires supérieures (Fig.  1 et données étendues Fig.  2a ). Dans les cellules épithéliales d’enfants et d’adultes positifs au SRAS-CoV-2, nous avons observé un niveau d’expression élevé de ces gènes (Fig.  2c) en particulier au début des symptômes de COVID-19 qui avaient tendance à diminuer jusqu’au jour 4 (jour 0-4, appelé phase précoce) et restaient à des niveaux inférieurs dans la phase ultérieure de la maladie (jours 5 à 12 après l’apparition des symptômes, référé à une phase tardive). On peut supposer qu’une expression basale plus élevée de ces PRR permettrait une détection immédiate du SRAS-CoV-2 par MDA5/LGP2 dans les cellules épithéliales infectées (Fig.  2a ). Étonnamment, les cellules épithéliales des voies respiratoires des enfants présentaient une expression accrue de ces gènes PRR par rapport au niveau d’expression de ces gènes dans les cellules épithéliales chez les adultes positifs pour le SRAS-CoV-2 (Fig.  2b ), en particulier dans la phase précoce de la maladie après l’apparition des symptômes. À partir du jour 5, la détection du virus est largement comparable entre les enfants et les adultes (Fig.  2b, parcelle inférieure).

Après la détection du virus, la signalisation via IRF3/NFκB conduit à l’expression d’effecteurs antiviraux primaires, ainsi que de cytokines antivirales telles que l’IFNβ et l’IFNλ (Fig.  2a ). Les IFN agissent sur les cellules épithéliales de manière autocrine et paracrine, augmentant encore la réactivité MDA5/LGP2 dans le tissu et induisant une large gamme de gènes stimulés par l’IFN (ISG). Bien que nous n’ayons pas été en mesure de détecter l’expression des IFN de type I et de type III eux-mêmes, les ISG ont montré un modèle d’activation impressionnant dans les cellules épithéliales des enfants positifs pour le SRAS-CoV-2, y compris de nombreux gènes précédemment montrés pour présenter une forte activité antivirale contre le SRAS- CoV-2, tels que LY6E (réf.  18 ), IFITM2 et BST2 (réf.  19). Dans toutes les cellules épithéliales, et en particulier dans les cellules ciliées, l’ampleur de l’expression de l’ISG a considérablement dépassé celle des adultes infectés dans les phases d’infection précoce et tardive (Fig. 2d et Extended Data Fig.  3 ) avec une tendance généralement à la baisse à la fin de l’ infection.  phase (données étendues Fig.  3 ).

Pour démontrer une association directe entre les niveaux d’expression de MDA5 et l’activation des ISG lors de l’infection par le SRAS-CoV-2, nous avons établi un modèle in vitro utilisant la lignée cellulaire épithéliale pulmonaire humaine A549, qui présente de très faibles niveaux d’expression basale de MDA5 similaires aux niveaux d’expression trouvés dans les cellules épithéliales nasales d’adultes sains. Comme prévu, sur la base d’une détection MDA5 inefficace de concert avec une réplication et une expression rapides d’antagonistes codés par le virus 20 , seules des quantités infimes de transcrits IFNB1 et ISG ont été induites lors de l’infection par le SRAS-CoV-2 dans ces cellules. Cependant, dans les cellules avec une expression basale modérément augmentée de MDA5 par transduction lentivirale, permettant une détection efficace du virus avant l’expression d’antagonistes, nous avons observé une induction significative de l’expression deIFNB1 et ISG clés, y compris MX1 , BST2 ( tétherine ), RSAD2 (vipérine) et IFIT1 (Fig.  2e ). Ces résultats corroborent le rôle central de l’expression de MDA5 avant l’infection pour détecter le SRAS-CoV-2 et induire une réponse ISG rapide et robuste.

Activation accrue des cellules immunitaires innées chez les enfants

L’étude des interactions entre les cellules immunitaires et les cellules épithéliales a révélé une plus forte conversation croisée entre les cellules immunitaires et épithéliales chez les enfants par rapport aux adultes, en particulier avant l’infection. Parmi les cellules immunitaires, les macrophages non résidents (nrMa) et les macrophages dérivés des monocytes (moMa) ainsi que les cellules dendritiques CD11c + (CD11c_mDC) étaient les plus interactifs (Fig.  3a ). Ces sous-ensembles de cellules immunitaires ont montré un statut d’activation plus élevé chez les enfants, comme en témoigne un niveau d’expression accru de plusieurs gènes codant pour les cytokines et les chimiokines tels que IL1B , IL8 , TNF , CCL3 et CCL4 (Fig.  3b ). Nous avons en outre observé un niveau d’expression amélioré de l’ IFIH1dans moMa, nrMa et CD11c_mDC chez les enfants infectés par le SRAS-CoV-2 et une augmentation significative de TLR2 dans moMa et nrMa dans la phase précoce de l’infection, suggérant que ces cellules pourraient jouer un rôle supplémentaire dans la détection du virus et la production d’IFN. Ceci est encore souligné par le fait que moMa, nrMa et CD11c_mDC des enfants SARS-CoV-2 négatifs ont exprimé IFIH1 et TLR2 à des niveaux plus élevés que ceux des adultes.

Fig. 3 : Réponse immunitaire différentielle chez les enfants et les adultes.
figure 3

a , Cartes thermiques illustrant les communications cellule-cellule entre tous les types cellulaires identifiés dérivés du nombre d’interactions ligand-récepteur à échelle linéaire chez les enfants (à gauche, n  = 18 SARS-CoV-2 négatif, n  = 11 SARS-CoV-2 positif infection précoce (dps ≤ 4), n  = 11 SARS-CoV-2 positif phase d’infection tardive (dps 5–12)) et adultes (à droite, n  = 23 SARS-CoV-2 négatif, n  = 13 SARS-CoV-2 positif phase d’infection précoce, n  = 8 phase d’infection tardive positive au SARS-CoV-2). b, Diagrammes de points représentant l’expression des gènes impliqués dans la réponse antivirale et cytotoxique des cellules dendritiques myéloïdes et de différentes populations de macrophages. Chaque augmentation significative comparant les enfants SARS-CoV-2-négatifs ( n  = 18) avec les adultes SARS-CoV-2-négatifs ( n  = 23) et les enfants SARS-CoV-2-positifs au début ( n  = 11) ou tard ( n  = 11) la phase d’infection avec des adultes positifs pour le SRAS-CoV-2 au milieu de la phase d’infection précoce ( n  = 13) ou tardive ( n  = 8), respectivement, est marquée par un cercle rouge (Benjamini-Hochberg-ajusté deux- Wilcoxon à queue, P  < 0,05). Ave. exp., expression génique moyenne; PCT exp., pourcentage de cellules exprimant le gène. c, UMAP affichant les différentes sous-populations de cellules T/NK dans le nez des enfants et des adultes. En comparaison, des graphiques de densité à l’échelle sont affichés indiquant la proportion des différentes cellules T/NK chez les enfants et les adultes séparés par leur statut d’infection par le SRAS-CoV-2. Le jaune représente une densité élevée; le bleu représente une faible densité. d , Graphiques de violon montrant l’expression de médiateurs immunitaires représentatifs de la sous-population CTL2 comparant les enfants SARS-CoV-2-négatifs ( n  = 18) avec les adultes SARS-CoV-2-négatifs ( n  = 23) et SARS-CoV-2-positifs enfants pendant la  phase d’infection précoce ( n  = 11) ou tardive ( n = 11) avec des adultes positifs pour le SRAS-CoV-2 au milieu de la phase précoce ( n  = 13) ou tardive ( n = 8) phase d’infection, respectivement. Chaque point représente une cellule. Les tracés montrent une médiane, *** P  < 0,001 ( IFNG négatif : 1,50 × 10 −17 , IFNG phase précoce : 1,14 × 10 −47 , IFNG phase tardive : 1,69 × 10 −27 , CCL5 négatif : 5,97 × 10 −30 , CCL5 phase tardive : 6,32 × 10 −73 ), dérivée d’une comparaison bilatérale de Wilcoxon.

Sous-populations distinctes de cellules immunitaires chez les enfants

Outre la capacité antivirale intrinsèque cellulaire régulée à la hausse des cellules épithéliales des voies respiratoires, des macrophages et des cellules dendritiques, nous avons trouvé des modèles spécifiques de sous-populations de cellules immunitaires chez les enfants par rapport aux adultes. Nous avons identifié, entre autres, une sous-population de cellules KLRC1 (NKG2A) + lymphocytes T cytotoxiques (CTL2) survenant principalement chez les enfants (Fig.  3c ). NKG2A est un récepteur inhibiteur de type lectine sur les cellules T cytotoxiques jouant un rôle dans la limitation de l’activation excessive, la prévention de l’apoptose et le maintien de la réponse des cellules CD8 + T spécifiques du virus 21 . Déjà sans infection virale, ce sous-ensemble de lymphocytes T cytotoxiques CD8 était caractérisé par un fort niveau d’expression de médiateurs cytotoxiques (Fig.  3d, données étendues fig.  4 et tableau supplémentaire  5 ). De plus, l’ IFNG était fortement exprimé dans ces cellules lorsque l’on comparait des enfants SARS-CoV-2 négatifs aux adultes. Lors de l’infection, les enfants étaient caractérisés par un niveau d’expression significativement plus élevé de l’ IFNG par rapport aux adultes à la fois dans la phase précoce et dans la phase ultérieure de l’infection. De même, le puissant gène chimiotactique CCL5 était augmenté chez les enfants par rapport aux adultes avec ou sans infection (Fig.  3d). Le potentiel cytotoxique et la prédominance de ce sous-ensemble de cellules T cytotoxiques nécessaires pour tuer efficacement les cellules infectées par le virus fournit une preuve supplémentaire d’une meilleure réponse antivirus chez les enfants par rapport aux adultes. De plus, les enfants infectés par le SRAS-CoV-2 présentaient une population distincte de cellules CD8 + T (CD8_T m ) avec un phénotype de mémoire presque absent chez les adultes (Fig.  3c , EDF4). On ne sait pas encore si ces cellules sont bénéfiques pour la protection des enfants contre une future réinfection.

Discussion

Nos données fournissent des preuves claires que les cellules épithéliales et immunitaires des voies respiratoires supérieures (nez) des enfants sont pré-activées et préparées pour la détection du virus. Il s’agit probablement d’une caractéristique générale de la réponse immunitaire muqueuse des enfants, mais particulièrement pertinente pour le SRAS-CoV-2. Très récemment, scRNA-seq de fibroblastes infectés par le virus Chikungunya a montré une fenêtre d’opportunité extrêmement étroite pour les cellules d’exprimer les IFN avant que la production de protéines virales ne coupe le système antiviral 22. Cela explique probablement également les différences entre le SRAS-CoV-2 et d’autres virus respiratoires, notamment le virus respiratoire syncytial, le virus de la grippe A ou le SRAS-CoV en termes de réponse induite de l’hôte. Le SRAS-CoV-2 se caractérise par une réplication intracellulaire étendue et une absence remarquable de production et de sécrétion d’IFN. D’autre part, le SRAS-CoV-2 est très sensible au traitement par IFN avant ou après l’infection, comme le montrent les cellules épithéliales pulmonaires, encore plus que le SRAS-CoV 20 , 23. La détection du virus amorcée et une réponse immunitaire innée pré-activée chez les enfants conduisent à une production précoce efficace d’IFN dans les voies respiratoires infectées, médiant probablement des effets antiviraux substantiels reflétant ceux observés in vitro dans des cellules (pré)traitées par IFN. En fin de compte, cela peut entraîner une réplication réduite du virus et une élimination plus rapide chez les enfants. En fait, plusieurs études ont déjà montré que les enfants éliminent beaucoup plus rapidement le SRAS-CoV-2 que les adultes, conformément au concept selon lequel ils arrêtent la réplication virale plus tôt 24 , 25 , 26 , 27. Pour d’autres virus respiratoires, tels que le virus respiratoire syncytial et le virus de la grippe A, qui induisent plus efficacement une réponse IFN par eux-mêmes, une réponse immunitaire innée pré-activée peut être moins pertinente. La capacité antivirale innée accrue chez les enfants ainsi que la sensibilité élevée à l’IFN du SRAS-CoV-2 peuvent expliquer pourquoi les enfants sont mieux à même de contrôler l’infection à un stade précoce par rapport aux adultes et ont donc un risque plus faible de développer un COVID-19 sévère.

Méthodes

Recrutement des patients et approbation éthique

Des individus de trois cohortes différentes ont été inclus dans cette étude. Les patients de l’étude de cohorte observationnelle prospective Pa-COVID-19 (réf.  28 ) et de son bras d’étude RECAST (Comprendre la résilience accrue des enfants par rapport aux adultes dans l’infection par le SRAS-CoV-2) ont été recrutés entre août 2020 et juin 2021 à la Charité – Universitätsmedizin Berlin. D’autres patients ont été recrutés dans l’étude prospective SC2 8 , 9 à l’hôpital universitaire de Leipzig entre mars 2020 et mai 2021. Un consentement éclairé écrit a été donné par tous les patients et/ou leurs parents avant l’inclusion. Les trois études ont été menées conformément à la Déclaration d’Helsinki et approuvées par les comités d’examen institutionnels respectifs (Pa-COVID-19/RECAST : EA2/066/20, SC2 : 123/20-ek).

Cohorte de patients

Parmi les trois cohortes, des patients classés comme asymptomatiques, légers ou modérés sur la base des directives de l’OMS 29 sur la gravité du COVID-19 ont été recrutés. Au total, nous avons analysé les écouvillonnages nasaux de 45 patients confirmés positifs pour le SRAS-CoV-2 comprenant 24 enfants âgés de 4 semaines à 17 ans (âge médian 9,0 ± 5,6 ans, 10 femmes, 14 hommes) et de 21 adultes entre 21 et 76 ans (âge médian 39,0 ± 10,4 ans, 12 femmes, 9 hommes). Aucun des enfants n’a été hospitalisé, mais tous étaient en quarantaine domestique. De plus, des écouvillonnages nasaux de 42 témoins sains et négatifs pour le SRAS-CoV-2 de 18 enfants entre 4 et 16 ans (âge médian 9,0 ± 3,8 ans, 8 femmes, 10 hommes) et de 23 adultes entre 24 et 77 ans ont été inclus ( âge médian 46,0 ± 16,3 ans, 13 femmes, 10 hommes ; Tableaux supplémentaires  3et 4 ). Tous les contrôles négatifs ont été examinés pour une éventuelle exposition au SRAS-CoV-2 par une anamnèse détaillée. Dans les cas d’expositions connues au SRAS-CoV-2, des tests sérologiques supplémentaires ont été effectués au moment de l’échantillonnage et après 14 jours ou des entretiens de suivi ont été menés pour s’assurer que le participant ainsi que les membres de son ménage ne présentaient aucun signe d’infection pour au moins deux semaines consécutives et que tout test de routine a donné des résultats négatifs.

PCR en temps réel pour le SRAS-CoV-2

L’ARN a été extrait à l’aide du kit MagNA Pure 96 DNA et Viral NA Small Volume (Roche) sur un système MagNA Pure 96, comme recommandé par le fabricant. Une PCR en temps réel avec transcription inverse a été réalisée en ciblant le gène de l’enveloppe (E) et le gène de la nucléocapside (N) sur le système Roche Light Cycler 480 (Tib-Molbiol).

Obtention d’une suspension unicellulaire à partir d’écouvillons nasaux humains, préparation pour scRNA-seq et prétraitement ultérieur des données brutes

Le traitement des échantillons, la préparation des cellules individuelles et des bibliothèques et l’analyse des données ont été effectués comme documenté précédemment 8 , 9 . Brièvement, des écouvillons nasopharyngés frais ont été transférés dans du milieu DMEM/F12 froid (Gibco, 11039) et traités en moins d’une heure. Sous biosécurité S2, un volume égal de 13 mM de dithiothréitol (AppliChem, A2948) a été ajouté à chaque échantillon. Pour obtenir des nombres de cellules plus élevés, la solution a été lentement pipetée de haut en bas et l’écouvillon a été plongé environ 20 fois dans le milieu. Après incubation à 37°C et 500 rpm pendant 10 min sur un thermomixer, les échantillons ont été centrifugés à 350 gà 4 ° C pendant 5 min et le surnageant lentement éliminé. Si le culot présentait le moindre signe de globules rouges, il était remis en suspension dans du PBS 1× (Sigma-Aldrich, D8537), traité avec du tampon de lyse des globules rouges (Roche, 11814389001) à 25 °C pendant 10 min et centrifugé à 350 g à 4°C pendant 5 minutes. Si les échantillons n’étaient pas traités immédiatement, le culot cellulaire était remis en suspension dans du DMEM/F12 additionné de 20 % de FBS (Gibco, 10500) et de 10 % de diméthylsulfoxyde (Sigma-Aldrich, D8418) et congelé à -80 °C. Pour les préparations de la bibliothèque, les cellules ont été décongelées à 37 °C, centrifugées à 350 gà 4 ° C pendant 5 min et traités selon le protocole. Pour obtenir une suspension unicellulaire, de l’Accutase (Thermo Fisher, 00-4555-56) a été ajoutée au culot et la solution a été incubée à température ambiante pendant 10 min avec pipetage soigneux des cellules après 5 min. L’incubation a été arrêtée par ajout de DMEM/F12 additionné de 10% de FBS et centrifugation à 350 gà 4°C pendant 5 minutes. Par la suite, le surnageant a été retiré et le culot cellulaire a été remis en suspension dans du PBS 1 x (le volume a été ajusté à la taille du culot cellulaire). La suspension a été débarrassée de tout débris cellulaire à l’aide d’un tamis cellulaire de 35 μm (Falcon, 352235), et par la suite, les cellules ont été comptées avec une chambre Neubauer jetable (NanoEnTek, DHC-N01). La suspension cellulaire a été diluée pour permettre le chargement de 17 500 cellules par échantillon. Une émulsion de code-barres à cellule unique et unique a été obtenue en mélangeant les cellules diluées avec le mélange maître et en les chargeant sur la puce avec les billes de gel et l’huile de partitionnement à l’aide du kit 10x Genomics Single Cell 3ʹ GEM, bibliothèque et gel Bead v3.1 (10x Genomics ; PN 1000120 ; PN 1000121; PN 1000213) et chargement de la puce dans le contrôleur 10x Chromium. La transcription inverse, le nettoyage et l’amplification d’ADNc suivants,ainsi que la préparation de la bibliothèque, ont été effectuées conformément au manuel du fabricant. Notamment, pour s’assurer que le virus était inactivé, nous avons prolongé l’incubation à 85 °C pendant la transcription inverse à 10 min. Les bibliothèques d’ARN 3′ finales ont été regroupées pour le séquençage sur une Flow Cell S2 ou S4 (S2 : jusqu’à 13 échantillons, S4 : jusqu’à 24 échantillons) et séquencées sur le système de séquençage NovaSeq 6000 (Illumina, paires d’extrémités, indexation unique) .extrémité appariée, indexation unique).extrémité appariée, indexation unique).

Les ensembles de données à cellule unique ont été alignés et prétraités à l’aide de Cellranger 3.0.1. Un génome de référence hg19 humain personnalisé (10x Genomics, version 3.1.0) avec le génome SARS-CoV-2 (Refseq-ID : NC_045512 ) ajouté en tant que chromosome supplémentaire a été utilisé. Pour l’analyse en aval, Seurat 3.2.2 a été utilisé. Les cellules avec moins de 3 gènes et les cellules avec plus ou égales à 15 % de lectures mitochondriales ou moins de 200 gènes exprimés ont été rejetées. Pour supprimer les doublets, un seuil pour le nombre d’identifiants moléculaires uniques et de gènes a été déterminé manuellement par échantillon.

Les échantillons ont été fusionnés et exportés sous forme de fichiers csv contenant des décomptes et des métadonnées et importés dans scanpy 1.6.0 30 . Après normalisation à 10 000 lectures par cellule, les valeurs d’expression ont été transformées en log et des gènes très variables ont été calculés, qui ont été utilisés comme base pour les étapes de prétraitement suivantes. Les données ont été mises à l’échelle, transformées en PCA et alignées à l’aide de l’harmonie 0,0,5 (réf.  31 ) sur la base de 100 composants principaux. Un alignement supplémentaire a été effectué à l’aide de bbknn 1.4.0 (réf.  32 ) sur la base de 50 composants principaux pré-alignés, de 10 arbres, de 3 voisins dans le lot et d’un réglage d’ajustement de 85. Sur la base des données intégrées, de l’intégration UMAP et de Leiden 33des regroupements ont été effectués. Ce regroupement a été utilisé comme base pour le sous-groupement des populations de cellules immunitaires et épithéliales avec le même algorithme. Des grappes de populations cellulaires épithéliales 34 , 35 , 36 et immunitaires 37 , 38 , 39 ont été attribuées à des types/stades cellulaires en fonction du niveau d’expression de différents gènes marqueurs (données étendues figures  1 et  4 ). Les amas de cellules T et de macrophages/cellules dendritiques ont été sous-clusters puis affinés manuellement.

L’objet a été stocké en tant que h5ad, converti en h5seurat à l’aide de SeuratDisk version 0.0.0.9014 et réimporté dans R version 4.1.0.

Au total, 268 745 cellules ont été incluses dans l’ensemble de données. Les nombres de cellules entre les groupes étaient également répartis (enfants négatifs 51 595 ; adultes négatifs 62 701 ; adultes positifs 51 500) à l’exception du groupe d’enfants positifs contenant des nombres de cellules plus élevés (102 949). Différents échantillons ont contribué à un nombre variable de cellules. Les pourcentages de contribution de chaque échantillon à son groupe d’étude ont été comparés à l’aide d’un test de Kruskal-Wallis, qui n’a pas indiqué de différences significatives entre les groupes ( P  = 0,2).

Pour permettre des comparaisons visuelles entre les UMAP de différents groupes, un nombre égal de cellules (45 000) par groupe a été échantillonné au hasard à l’aide de la fonction SubsetData dans Seurat.

Les interactions cellule-cellule putatives ont été quantifiées à l’aide de CellPhoneDB version 2.1.2 en utilisant les paramètres par défaut 40 . Pour réduire l’influence des échantillons individuels contribuant à un plus grand nombre de cellules et accélérer le calcul, nous avons limité le nombre de cellules par échantillon à 2 000 cellules échantillonnées au hasard. Cela a été fait en utilisant la fonction SubsetData dans Seurat.

Identification du jeu de gènes ISG

Pour l’analyse des réponses PRR/IFN, un ensemble de gènes des ISG les plus importants exprimés par les cellules épithéliales pulmonaires a été assemblé. Comme décrit précédemment 9 , nous avons traité des cellules épithéliales A549 avec un mélange d’IFNβ et d’IFNλ pendant 2, 8 ou 24 h, et analysé les niveaux de transcrits par des analyses de puces à ADN à l’aide de la plate-forme Illumina Human HT-12 v3 Expression Beadchip au centre de génomique et de protéomique. chez DKFZ. Nous avons identifié les ISG comme présentant un log 2 [changement de fois] > 0,8 à tout moment, produisant 183 gènes. Nous avons également inclus les ISG décrits comme présentant une forte activité anti-SRAS-CoV-2 19 (65 gènes les mieux notés ) s’ils ne sont pas déjà inclus dans notre liste. Cela a finalement donné un ensemble de gènes de 217 gènes également exprimés dans notre scRNA-seq.

Infection par le SRAS-CoV-2 des cellules A549 exprimant MDA5

Des cellules A549 transduites de manière stable avec un vecteur lentiviral exprimant IFIH1 humain sous le contrôle du promoteur murin ROSA26 (appelé A549 MDA5 high sur la figure  2e ) ont été fournies par Nadine Gillich et Ralf Bartenschlager. Nous avons transduit A549 (appelé MDA5 low ) et A549 MDA5 highcellules utilisant des vecteurs lentiviraux codant pour l’ACE2 et le TMPRSS2 humains pour les rendre permissives pour l’infection par le SRAS-CoV-2 ; pour assurer une expression cohérente de ACE2/TMPRSS2 à travers les expériences, la transduction a été fraîchement effectuée 24 h avant l’infection des cellules. L’infection par le SRAS-CoV-2 (souche BetaCoV/Allemagne/BavPat1/2020) a été réalisée dans notre installation BSL3 à une multiplicité d’infection de 0,1, et les cellules ont été collectées 24 h après l’infection. L’ARN a été extrait à l’aide du kit Monarch Total RNA Miniprep (New England Biolabs) et transcrit en inverse par le kit de transcription inverse d’ADNc à haute capacité (Thermo Fisher Scientific). IFNB1et les niveaux de transcrits ISG ont ensuite été évalués par PCR en temps réel à l’aide de l’iTaq Universal SYBR Green Supermix (BioRad) sur un système de détection par PCR en temps réel BioRad CFX96. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sem de trois répétitions biologiquement indépendantes.

Statistiques

L’expression différentielle des gènes a été calculée à l’aide de rank_genes_groups() dans la version scanpy 1.6.0 et corrigée des taux de fausses découvertes avec la version 0.9.0 de statsmodels (réf.  41 ). Les différences dans les compositions de type cellulaire/stade ont été évaluées à l’aide du test de somme des rangs de Kruskal-Wallis suivi du test post hoc de Dunn bilatéral. Les dépendances selon l’âge ont été calculées en ajustant un modèle de régression linéaire corrigé pour le statut COVID-19 et en ajustant les valeurs P du test F à l’aide de la méthode Benjamini-Hochberg 42 .

Les valeurs P pour les dot plots et les violin plots ont été calculées à l’aide de la fonction Seurat FindMarkers() basée sur le test de Wilcoxon et corrigées avec la méthode Benjamini-Hochberg 42 .

Pour tester si les niveaux élevés de MDA5 et de RIG-I dans les cellules A549 augmentaient significativement par l’ induction d’ IFNB1 et d’ISG lors de l’infection, un test t de Student unilatéral non apparié de trois répétitions biologiquement indépendantes a été effectué (GraphPad Prism v9.1).

Résumé des rapports

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la  nature lié à cet article.

Disponibilité des données

Les données traitées sous forme d’objet Seurat sont disponibles sans restriction d’accès sur FigShare ( https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14938755 ). Cet ensemble de données peut être utilisé pour reproduire et étendre les analyses présentées dans cet article. En raison du risque potentiel de désidentification des données RNA-seq pseudonymisées, les données de séquençage brutes peuvent être obtenues via EGA ( EGAS00001005461 ) uniquement à des fins de recherche non commerciale, sous réserve d’un accès contrôlé tel que requis par les lois de l’UE sur la protection des données. Pour y accéder, contactez l’auteur correspondant, RE De plus, ces données peuvent être davantage visualisées et analysées dans l’explorateur de données Magellan COVID-19 à l’ adresse https://digital.bihealth.org .

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